研究文献：《人参皂甙Rg3对K562细胞增殖及细胞周期的影响》
文献来源：《实用医学杂志》
作者：肖凤 刘彬 王伴青 方木水 胡玮 孙续禄 朱清仙
目 的：研究人参皂甙Rg3(ginsenoside，Rg3)对白血病K562细胞的作用及其相关机制。
方 法：将白血病K562细胞分为对照组和Rg3组，Rg3组包括10、20、40、80、100μg/mL组，培养24、48、72 h，四氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活性(本文结果未列)。再将K562细胞分为对照组和实验组(80μg/mLRg3组)，培养24、48、72 h，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)标记实验观察细胞的增殖情况，流式细胞仪分析细胞 24 h、48 h、72 h时细胞周期的变化情况。
结 果：BrdU标记测定显示，免疫细胞化学染色显示白血病K562细胞呈阳性反应，BrdU阳性细胞数分别为：对照组24 h(28.4±3.0)、48 h(31.4±3.3)、72 h(38.1±4.0)，Rg3组24 h(22.7±2.5)、48 h (17.3±2.9)、72 h(19.1±1.1)，均具有统计学意义(P<0.01);流式细胞仪检测显示：48 h Rg3组细胞周期的G2期增高了3.84倍。
结 论：人参皂甙Rg3可抑制K562细胞增殖，其机制可能与人参皂甙 Rg3将K562细胞周期阻滞在G2期，使细胞不能进行正常的有丝分裂，从而抑制了细胞的增殖有关。
近年研究发现，从人参中提取的皂甙单体成分Rg3 具有显著的抗大肠癌、肺癌和卵巢癌等多种肿瘤生长和转移的作用，且对骨髓、心、肺、肝、肾和神经系统无毒副作用，并与化疗药物联合应用能够起到协同增效的作用[1-3]。其中20(R)-人参皂甙Rg3(简称人参皂甙Rg3)的抗肿瘤作用最为明显[4-5]。白血病的治疗目前仍以传统的大剂量联合化疗为主，而大部分化疗药物对患者免疫系统产生很大的破坏，且存在增加患第二种肿瘤的可能性[6]。本文初步探讨人参皂甙Rg3对K562细胞增殖、凋亡及其细胞周期的影响，为白血病的临床治疗提供实验依据和理论。
1 材料与方法
1.1 材料
K562细胞株(江西省分子医学重点实验室惠赠); 人参皂甙Rg3(购自大连富生制药公司);5-溴脱氧尿嘧啶核苷、抗BrdU及羊抗小鼠FITC(均购自Sigma公司);1640培养基(购自美国GIBG0 公司);DMS0(购自美国Merk公司);小牛血清(购自杭州四季清公司);倒置显微镜(Olympus公司，CKC-TR-2W);流式细胞仪(美国BectonDickinson公司，FACS Calibur)。
1.2 方法
1.2.1 靶细胞和细胞培养[7]
K562细胞用含10%小牛血清的完全1640培养液置于37℃、5%的CO2细胞培养箱中进行常规培养。所有实验均在细胞处于对数生长期时进行。具体步骤参见文献。
1.2.2 细胞增殖检测[8]
K562细胞维持培养时，加入终浓度为16μg/mL的BrdU，按上述条件继续培养72 h;将K562细胞接种于96孔板，分为对照组(正常培养)和Rg3组(80μg/mL)，分别继续培养24、48、72 h 后行免疫荧光染色。具体步骤参见文献，并在激发光波长495nm，滤色光波长525nm荧光显微镜下观察，进行阳性细胞计数，图像扫描分析仪分析结果。
1.2.3 流式细胞仪检测[9]
K562细胞接种于96孔板，分为对照组(正常培养)和Rg3组(80μg/mL)，分别继续培养24、48、72 h，收集K562细胞于10mL离心管中，1000 r/min离心5 min，去上清，加PBS重悬细胞，洗涤2遍;PBS洗涤后，弃上清，以残留于管底的少量液体将细胞彻底重悬，务必要防止细胞成团。加入1mL的70%预冷乙醇固定，移入1.5mLEp管中，流式细胞仪检测出不同时间点细胞周期各时相的比例。
1.2.4 统计学处理
采用SPSS12.0软件分析，结果以x±s表示，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 人参皂甙Rg3对BrdU阳性细胞表达的影响
BrdU标记测定显示：免疫细胞化学染色显示，白血病K562细胞呈阳性反应，BrdU阳性细胞数分别为对照组24 h(28.4±3.0)、48 h(31.4±3.3)、72 h(38.1±4.0)，人参皂甙Rg3组24 h(22.7±2.5)、48 h(17.3±2.9)、72 h(19.1±1.1)，均具有统计学意义(P<0. 01)(表1);荧光染色后镜下观察显示，Rg3处理组BrdU标记的细胞数明显比对照组少，细胞体积稍变大(图1)。
注：A，对照组24 h；B， 对照组48 h；C，Rg3组24 h；D，Rg3组48 h
图1 80μg／mL Rg3对K562细胞增殖的影响
2.2 Rg3对K562细胞细胞周期的影响
流式细胞仪检测培养48h的细胞结果显示，对照组细胞的G1期为32.45%，S期为63.99%，G2期为3.56%，表明K562细胞处于增殖旺盛状态。Rg3组细胞G1期为40.33%，S期为46%，G2期为13.67%，与对照组细胞相比，Rg3处理的K562细胞的G2期比对照组增高了3.84倍，提示Rg3作用K562细胞48h时，能将细胞周期阻滞在G2期，使部分细胞不能进行正常的有丝分裂，从而抑制了K562细胞的增殖(图2、3 和表1)。
3 讨论
近年来大量研究证实多种中药具有诱导细胞凋亡、逆转耐药的作用，并已成为抗肿瘤肿瘤的研究热点[10]。文献资料显示，BrdU为胸腺嘧啶的衍生物，活体注射或加入细胞培养液中，而后利用抗BrdUmAb，显示增殖细胞，可作为反映细胞增殖活性的指标确切可靠[11-12]。我们采用BrdU标记测定，经人参皂甙Rg3作用后，荧光染色图像分析发现K562细胞数量均有不同程度的减少，其中24、48、72 h人参皂甙Rg3组均明显少于对照组。本实验提示，人参皂甙Rg3可抑制K562细胞增殖并诱导细胞凋亡。
人参皂苷Rg3主要作用于细胞增殖周期的G2/M期，诱导肿瘤细胞凋亡，是一种很有效的、通过诱导细胞凋亡而杀死肿瘤细胞的抗肿瘤药物[13-15]。我们检测了Rg3处理后K562细胞的细胞周期变化情况。结果发现，Rg3处理K562细胞48 h时，其G2期比对照组增高了3.84倍，表明Rg3将细胞周期阻滞在G2期。G2期也叫DNA合成后期，在G2周期时相，一些与有丝分裂相关的蛋白质，如微丝、微管蛋白、有丝分裂因子等合成结束，为有丝分裂作准备，这提示Rg3阻止了细胞的有丝分裂，最终抑制了细胞的恶性增殖，这与细胞生长曲线所显示的结果相符。
本研究证实，Rg3对白血病细胞的增殖具有明显的抑制作用，并且能诱导白血病细胞凋亡。Rg3具有抗白血病的作用，可能主要是通过人参皂苷Rg3作用于K562细胞增殖周期的G2/M期，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡实现的。至于Rg3对K562细胞抑制增殖和诱导细胞凋亡[16]作用的具体机制还待进一步的探索。
参考文献
[1] Xu T M，Cui M H，Xin Y，et al.Inhibitory Effect of Ginsenoside Rg3 on Ovarian Cancer Metastasis[J].Clin Med J，2008，121(15)：1394-1397.
[2] 丁小文，郑树，彭佳萍，等.人身皂甙Rg3对实验性小鼠大肠肿瘤的预防作用[J].中华肿瘤防治杂志，2006，13(1)：25-28.
[3] Xu T M，Xin Y，Cui M H，et aL.Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 combined with cyclophosphamide on growth and angiogenesis of ovarian cancer[J].Chin Med J，2007，120(7)：584-588.
[4] Wang C Z，Aung H H，Ni M，et a1.Red American ginseng：ginsengoside constituents and antiproliferative activities of heatprocessed Panax quinquefolius roots [J]. Planta Mad，2007，
73(7)：669-674.
[5] 王吉，史桂英，袁耀宗，等.人参皂甙Rg3在体外对胃癌细胞生长和凋亡的影响[J].上海交通大学学报：医学版，2009，29(11)：1336-1340.
[6] 赵春红，侯明.天然药物诱导分化研究现状[J].白血病淋巴瘤， 2006，15(1)：69-71.
[7] 易娟，陈静，孙静，等.小白菊内酯对白血病K562细胞及其
干细胞的作用[J].中国中药杂志，2010，35(2)：219-222.
[8] 张建平，司银楚，朱培纯.人参皂苷Rg1诱导大鼠海马神经干细胞分化的实验研究[J].神经解剖学杂志，2009，25(3)：335-338.
[9] 袁媛.外源性Wnt5a诱导K562细胞定向分化的研究[D].重庆： 第三军医大学，2007.
[10] 董瑞红，陆志刚.吴茱萸碱诱导不同起源的白血病细胞凋亡的研究[J].实用医学杂志，2011，27(10)：1722-1724.
[11]袁哓军，罗春华，廖清奎，等.全反式维甲酸对K562细胞的诱导分化及 c-myc 基因表达的抑制[J].国外医学：输血及血液学分册，2001，24(5)：445-448.
[12] Tatsuki I，Takao S，Shigeo H，et al.Isolation of neural stem
cells from damaged rat cerebral cortex after traumatic brain injury[J].Neuroreport，2005，16(15)：1687-1691.
[13] 张建平，司银楚， 胡煜辉，等.人参皂苷Rg1对成年大鼠脑缺血海马区神经干细胞的影响[J].第四军医大学学报，2008，29 (24)： 2225-2228.
[14] 张南生，张秀华，李文峰.人参皂苷Rg3的研究进展[J].医
药导报，2006，25(7)：687-689.
[15] 姜新，曲雅勤，贾晓晶，等.人参皂苷Rg3抑制B16黑色素瘤
生长和诱导凋亡的实验研究[J].中国实验诊断学，2006，10(6)： 593-595.
[16] 葛宇松，尹琳，滕伟禹，等.亲环素A对Aβ25-35诱导PC12
细胞凋亡的影响及机制研究[J].中华神经医学杂志，2011，10(6)：582-586.
